【LIQUID】鎖相放大器用於生物樣品雙通道和多儀器模式SRS顯微技術的研究
一、簡介
Moku：Pro 的鎖相放大器（LIA）為受激拉曼散射（SRS）顯微鏡實驗中的自外差訊號檢測提供了一種直覺、精確且穩定的解決方案。高品質的 LIA 是 SRS 顯微鏡實驗中具有數據傳輸檢測方案的關鍵硬體元件。在此更新的案例研究中，我們提供了有關雙 LIA 應用程式的更多詳細資訊和描述。
由於SRS (受激拉曼光譜技術)是一種使用泵和 Stokes（圖 1）兩個同步的脈衝雷射器(圖1)來激發分子振動的連貫拉曼散射過程，可以使用光譜和空間訊息進行化學影像。當入射到樣品上的兩束雷射的頻率差與目標分子的振動頻率相匹配時，就會發生 SRS 過程。 振動激發的結果是泵浦光束將失去光子，而Stokes光束將獲得光子。當檢測到泵浦光束的損失時，這稱為受激拉曼損失（SRL）檢測。 強度損失 ΔIp/Ip 通常約為 10 -7 -10 -4，遠小於典型的雷射強度波動。為了克服這一挑戰，需要一種高頻調製和相敏檢測方案來從雜訊的背景中提取 SRS 訊號。在 SRL 檢測方案中，Stokes光束以固定頻率調製，由此產生的調製傳輸到泵浦光束由 LIA 檢測。
圖 1：受激拉曼損耗檢測方案。
檢測到由於 SRS 引起的 Stokes 到泵浦光束的調幅傳輸。演示的泵浦光束具有 80 MHz 的重複率，Stokes 光束具有相同的 80 MHz 重複率，但也以 20 MHz 進行調製。 Δpump 是 LIA 在此檢測方案中提取的內容。
二、實驗裝置
使用的雷射系統能夠輸出兩個 80 MHz 的雷射脈衝序列：Stokes光束在 1030 nm，泵浦光束在 790 nm。雷射輸出也用於同步數據：80 MHz 參考被發送到分頻器產生 20 MHz TTL 輸出。這些 20 MHz 輸出被使用兩次：一次作為電光調製器來調製Stokes光束的驅動頻率，另一次作為外部鎖相環的 LIA 輸入通道 2（B 中）的參考。泵浦光束由矽光電二極管檢測，然後被發送到 LIA 的輸入通道 1（In A）。來自輸出通道 1（Out A）的訊號被發送到資料擷取卡以進行影像擷取。來自輸出通道 2（Out B） 的訊號被最小化（通過調整相移）。
2.1 單通道鎖相放大器配置
圖 2：典型的鎖相放大器配置設定。
圖 2 演示了用於 SRS 顯微鏡實驗的 LIA 的初始設定。 在初始設定時，必須重新獲取鎖相環。輸入均配置為 AC：50 歐姆。 通過調整相位角最佳化相移 （Df），直到 Out A 最大化（正值）並且 Out B 最小化（接近零）。 探針A顯示對應於 DMSO 最高訊號峰 （2913 cm-1 ） 的 SRS 訊號，並最大化輸出 A 的 103.3 mV。 探針B表示正交輸出，最小化為零。一旦 LIA 針對校正溶劑進行了最佳化，樣品就可以進行影像了。
圖 3：2930 cm -1拉曼躍遷處的 SRS HeLa 細胞圖片
圖 3 是使用 Moku：Pro 鎖相放大器拍攝的 HeLa 細胞圖片。顯示的圖片是從 SRS 圖片產生的，拉曼位移為 2930cm-1，對應於蛋白質峰。低通濾波器設置為 40 kHz，對應於 約4μs 的時間常數。 可以根據SRS訊號大小增加或減少增益。
2.2 雙通道影像
Moku：Pro 的 LIA 也適用於即時雙色 SRS 影像。 這是通過在 SRS 成像中應用正交調製並檢測LIA的X和Y輸出來執行的。 在這種情況下，Stokes調製有兩個部分：一個 20 MHz 脈衝序列產生SRS訊號，另一個 20 MHz 脈衝序列具有90°相移，產生另一個針對不同拉曼波段的SRS訊號。由於90°相移，兩個通道（Out A和Out B）彼此正交，可以同時獲取兩個SRS影像而不會受到干擾。
圖 4：使用正交調製和輸出在兩個不同的拉曼躍遷下同時獲得鼠腦樣本的雙通道 SRS 圖片。
圖 4 是利用雙通道X&Y輸出同時在2930 cm -1和 2850 cm -1處生成兩個 SRS 圖像的代表性圖片。
2.3 多儀器模式應用
在大多數 SRS 顯微鏡實驗中，由於雷射器總頻寬的限制，光譜範圍被限制在大約 300 cm -1左右。繞過這一技術障礙的一種方法是使用可調諧雷射器掃描波長。然而，波長調諧速度很慢，而且對於時間敏感的實驗（如活細胞影像）來說往往不夠。應對這一挑戰的另一種解決方案是引入第三束雷射束來掃描不同的拉曼躍遷區域。這種能力對於兩個光譜區域的同時成像特別有吸引力：一個在指紋區域（例如約1600 cm-1用於Amide vibration）和一個在CH區域（例如約2900 cm -1蛋白質）。在SRL 影像方法中，實驗裝置由一個Stokes光束和兩個不同波長的泵浦光束組成。此設定的常用檢測方法需要單獨的檢測器和單獨的LIA。然而，Moku：Pro 的多儀器模式允許部署多個LIA，因此可以在不需要任何額外硬體的情況下實施第二個LIA。
圖 5：Moku：Pro 多儀器鎖相放大器配置
圖 5 演示了LIA 的多儀器模式設定，用於同步 SRS 顯微鏡實驗。 對於Slot 1，In 1是第一個光電二極體的檢測訊號，In 2是參考訊號，Out 1是發送到資料擷取卡的訊號，Out 3被丟棄。 對於 Slot 2，In 3 是第二個光電二極體的檢測訊號，In 2 再次作為參考，Out 2 是發送到資料擷取卡的訊號，Out 4 被丟棄。此配置僅使用 4 個 Moku 插槽中的 2 個。 插槽 3 和 4 未分配，因此可用於進一步的 LIA 或任何其他 Moku 儀器。輸入全部配置為 AC：50 歐姆。 每個 LIA 插槽（1 和 2）都遵循與單通道 LIA 配置相同的設置。
在三個雷射器的情況下，Moku：Pro 的多儀器模式可以配置兩個鎖定放大器，將系統簡化為一個設備，而不會造成任何影響。這使得研究人員可以同時拍攝兩張波數差較大的 SRS 圖片，利用一個 Moku：Pro 來處理兩個光電二極管檢測器訊號。
圖 6：HeLa 細胞 SRS 圖像使用多儀器設置在間隔較遠的拉曼躍遷處拍攝。
圖 6 是利用一個Moku：Pro處理兩個光電二極管檢測器訊號同時拍攝兩個波數差較大的 SRS 圖像的代表性圖片。
三、結論
Moku：Pro 的 LIA 為大量 SRS 顯微鏡實驗提供了出色的解決方案。在本文檔中，討論了典型的單通道 SRS 影像、雙通道影像和多儀器影像。 用戶介面允許對提取低強度 SRS 訊號進行直觀和強大的控制。 重要的是 Moku：Pro 的多儀器工具功能允許在多儀器同用的小型系統上進行複雜的影像實驗。
圖 7：Moku：Pro 在多儀器模式下的使用照片。
In 1 和 In 3 分別是插槽 1 和插槽 2 中 LIA 的訊號輸入。 2 中是兩個 LIA 插槽的參考。
在所示的配置中，Out 1 和 Out 3 是記錄的訊號，Out 2 和 Out 4 是插槽 1 和 2 的轉儲訊號。
